生物學(xué)檢測方法研究生物活性物質(zhì)之間相互作用及其影響，或者利用生物活性物質(zhì)之間相互作用進(jìn)行定量，是生命科學(xué)研究領(lǐng)域和藥物研發(fā)過程中必不可少的工具。有別于色譜質(zhì)譜拉曼光譜等儀器分析方法，生物學(xué)檢測方法往往是間接的，其間接性導(dǎo)致方法可靠性，穩(wěn)定性等相對于儀器分析方法較差。從整體宏觀的角度了解生物學(xué)檢測方法的間接性是建立一個(gè)穩(wěn)定的生物學(xué)檢測方法的關(guān)鍵因素之一。

儀器分析方法(a)研究的是樣品本身直接相關(guān)的特性，如樣品的分子量大小，樣品的電荷等；與此相對，生物學(xué)檢測方法（b）首先要存在或者建立一個(gè)Test system，然后加入樣品反應(yīng)，檢測樣品引起Test system的變化，其檢測和樣品本身是間接相關(guān)，檢測目標(biāo)分子實(shí)體不是樣品本身，這是其檢測目標(biāo)的間接性。如某藥物對腫瘤細(xì)胞的殺傷實(shí)驗(yàn)，Test system為細(xì)胞，引起的變化是細(xì)胞的死亡，檢測目標(biāo)分子實(shí)體為代表活細(xì)胞的ATP濃度或者代表死細(xì)胞的LDH濃度。 

大多數(shù)生物學(xué)檢測方法存在一個(gè)復(fù)雜的Test system，樣品引起Test system的變化也需要在溫和的條件下進(jìn)行，這使得目標(biāo)分子很難進(jìn)行有效的分離并采用儀器分析方法進(jìn)行檢測，需要引入熒光標(biāo)記抗體，酶標(biāo)抗體，或酶催化底物等和目標(biāo)分子進(jìn)行反應(yīng)轉(zhuǎn)換成信號值，建立信號值和目標(biāo)分子的間接聯(lián)系，這是檢測信號傳遞的間接性。如下圖所示，在一個(gè)ELISA直接法的實(shí)驗(yàn)中，樣品是抗體，檢測體系是抗原，引起的變化目標(biāo)分子抗體-抗原偶聯(lián)物，而信號值代表的是TMB催化產(chǎn)物，TMB催化產(chǎn)物經(jīng)過酶標(biāo)抗體和目標(biāo)分子抗體-抗原偶聯(lián)物發(fā)生間接聯(lián)系，一個(gè)ELISA方法的質(zhì)量是由信號在間接的傳遞過程中是否和目標(biāo)分子抗體-抗原偶聯(lián)物線性相關(guān)決定的。相關(guān)研究請參閱小編之前的文章ELISA常用原理類型方法和常見問題匯總

生物學(xué)功能評價(jià)和檢測分析方法的雙重間接性為檢測目標(biāo)的間接性和檢測信號傳遞的間接性。即使最為簡單的生物學(xué)檢測方法，配體受體結(jié)合實(shí)驗(yàn)在實(shí)際的應(yīng)用過程中由于這兩重的間接性導(dǎo)致其方法也變得無比復(fù)雜，存在很多的變量，很容易出現(xiàn)假陽性或者假陰性的結(jié)果。一個(gè)檢測方法在方法開發(fā)的初期往往需要進(jìn)行分步的實(shí)驗(yàn)來優(yōu)化方法的可靠性和穩(wěn)定性，并對建立的方法進(jìn)行初步的方法學(xué)驗(yàn)證。明確需要檢測的目標(biāo)分子，信號和目標(biāo)分子的關(guān)聯(lián)途徑是進(jìn)行方法學(xué)開發(fā)，數(shù)據(jù)解讀和問題排查的基礎(chǔ)。

一般來講，競爭法實(shí)驗(yàn)主要涉及到三個(gè)物質(zhì)，受體，配體和阻斷配體受體結(jié)合的樣品，如PD1受體，PD-L1配體，阻斷劑keyturda抗體，也常采用抗原，生物素化抗體，和阻斷抗原，生物素化抗體的樣品抗體組合。在競爭法開發(fā)的初期是建立起受體，配體相互作用的Test system。Test system的條件直接決定了競爭法實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確度和測量范圍。具體到ELISA競爭法方法開發(fā)上，主要包含兩個(gè)方面：

1.設(shè)置多個(gè)陰性陽性對照組，確認(rèn)實(shí)驗(yàn)信號值是真實(shí)代表目標(biāo)分子配體受體偶聯(lián)物。主要考察的是在間接的檢測過程中ELISA反應(yīng)過程采用的酶標(biāo)板材，酶聯(lián)抗體和顯色液等試劑耗材是否干擾Test system。如下圖所示，嚴(yán)格來講在新建一個(gè)ELISA方法時(shí)，需要建立一個(gè)陽性反應(yīng)組組5，需要建立多個(gè)陰性對照組組1-組4來確認(rèn)Test system中信號是和目標(biāo)分子相關(guān)。這是一個(gè)十分重要，也是十分容易被忽略的問題。除了組5能夠得較高的陽性信號，其他分組如果得到較強(qiáng)的陽性信號，整個(gè)方法得到的數(shù)據(jù)都是不可信的。組3和組5（黃色）是ELISA實(shí)驗(yàn)常用的對照組，但是組4（藍(lán)色）的缺席會使得整個(gè)方法充滿分險(xiǎn)性，小編多個(gè)不同ELISA應(yīng)用方法學(xué)開發(fā)的經(jīng)驗(yàn)表明，很多時(shí)候封閉劑起無法達(dá)到占據(jù)酶標(biāo)板材空白位置的目的，反應(yīng)配體或者反應(yīng)配體中的非特異成分可能會直接吸附在酶標(biāo)板材上，導(dǎo)致組4出現(xiàn)劑量依賴的假陽性信號。在雜交瘤和噬菌體展示篩選測定時(shí)，反應(yīng)配體溶液的復(fù)雜和多樣性，使得配體溶液總會存在某些陰性抗體或者克隆能夠和酶標(biāo)板材結(jié)合，成分組4的缺席會導(dǎo)致假陽性克隆出現(xiàn)的頻率大大增加。設(shè)置比較全的陰性對照組也有助于鎖定整個(gè)體系中哪些試劑發(fā)生了交叉反應(yīng)，找到具體原因，方便更換試劑。 

2.包被受體相對于反應(yīng)配體的劑量曲線。在確認(rèn)Test system中陽性信號能夠代表目標(biāo)檢測分子后，包被少量的受體，2倍梯度稀釋反應(yīng)配體12-16個(gè)點(diǎn)進(jìn)行全曲線擬合，選取EC80或者EC50的配體濃度作為競爭法反應(yīng)濃度。如下圖所示100ng/ml 受體100ul包被，受體從100000ng/ml 2倍梯度稀釋到0.2ng/ml，采用不同稀釋濃度的酶聯(lián)抗體進(jìn)行檢測，整個(gè)劑量曲線有明顯的上，下平臺期，不同的酶聯(lián)濃度對信號的線性傳遞未造成明顯的影響，酶聯(lián)抗體起到了等比例將信號放大的作用，EC50為12ng/ml，EC80為40ng/ml。可選取100ng/ml 受體100ul包被，配體的競爭濃度選EC80為40ng/ml，酶聯(lián)稀釋度選擇1：600以獲得較大的信噪比窗口，增加方法測量范圍。在競爭法實(shí)驗(yàn)中EC80代表了配體在Test system中占據(jù)了受體80%的結(jié)合位點(diǎn)，配體和受體在此相對狀態(tài)下，樣品對配體和受體的反應(yīng)的阻斷比較敏感。受體過多，可提供的結(jié)合位點(diǎn)較多，樣品和受體結(jié)合不會影響到配體和受體的結(jié)合；配體過多，樣品加入后相對于配體較少，競爭不過配體，絕大多數(shù)配體依舊和受體結(jié)合，在兩種情況下樣品的加入都無法導(dǎo)致Test system發(fā)生明顯的變化（配體受體偶聯(lián)物減少），信號變化不明顯。 

建立好完整的Test system后，就是正式建立競爭法的劑量曲線了。主要包含兩個(gè)方面的內(nèi)容

1.將選定EC80濃度的配體和梯度稀釋的樣品（2倍梯度稀釋12-16個(gè)點(diǎn)）混勻后加入包被好受體的酶標(biāo)板材反應(yīng)，得到有明顯上下漸近線的全曲線，如下圖所示。 

2.根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪M(jìn)行，選擇樣品合適的8個(gè)濃度梯度點(diǎn)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，簡化實(shí)驗(yàn)操作流程，并初步評估方法的質(zhì)量。具體到應(yīng)用方面就是親和力大小比較和定量檢測方面。根據(jù)筆者的對比研究，發(fā)現(xiàn)ELISA競爭法相同條件下的同一個(gè)曲線在濃度點(diǎn)細(xì)微調(diào)整下能夠滿足兩方面的需求，這是筆者開創(chuàng)性的發(fā)現(xiàn)，希望業(yè)界更多的同行能夠進(jìn)行驗(yàn)證。下文會具體進(jìn)行兩方面應(yīng)用方法的初步評估。

當(dāng)ELISA競爭法開發(fā)以親和力大小比較為目的，往往會以IC50值評價(jià)待測樣品阻斷配體受體結(jié)合效果，IC50越小，待測樣品的阻斷效果越好。親和力競爭法開發(fā)的劑量曲線應(yīng)該有明顯的上下平臺期以得到較為穩(wěn)定的IC50值。生物學(xué)活性的方法學(xué)驗(yàn)證可參照USP1032, 1033,1034來進(jìn)行實(shí)驗(yàn)方案的設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)分析。具體到ELISA競爭法的方法學(xué)評價(jià)，即制備相對于對照品理論效價(jià)為156%，125%，100%，80%，64%的樣品進(jìn)行檢測，通過比較對照品和樣品的IC50，得到樣品相對于實(shí)測效價(jià)，通過實(shí)測效價(jià)和理論效價(jià)的差異初步確認(rèn)以親和力大小比較為目的的ELISA競爭法的質(zhì)量。承接上文的全曲線選擇合適的8個(gè)濃度點(diǎn)，進(jìn)行初步的方法學(xué)驗(yàn)證的結(jié)果如下圖所示：該單次實(shí)驗(yàn)如果進(jìn)行多人和關(guān)鍵試劑的多批次實(shí)驗(yàn)，得到的實(shí)測效價(jià)經(jīng)過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析將構(gòu)成方法學(xué)驗(yàn)證中最主要的幾個(gè)概念，精密度，準(zhǔn)確度，線性和范圍。如結(jié)果顯示單次實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)測效價(jià)和理論效價(jià)的差異在5%以內(nèi)，能夠初步判斷該以親和力大小比較為目的ELISA競爭法有較好的方法質(zhì)量。 

當(dāng)ELISA競爭法開發(fā)以定量為目的，選取7個(gè)點(diǎn)以理論濃度為X軸，信號值為Y軸進(jìn)行四參數(shù)函數(shù)擬合得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，將對照品的信號值重新代入標(biāo)準(zhǔn)曲線可得回測濃度值，多次實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析后回測濃度值和理論值的偏差決定了該條標(biāo)準(zhǔn)曲線的檢測上限，檢測下限，測量范圍，更加詳盡的方法學(xué)驗(yàn)證可參照2015版中國藥典第三部9012 生物樣品定量分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則或者美國FDA最新版本的Guidance for Industry Bioanalytical Method Validation相關(guān)論述。如下圖所示，對照品在12.5ng/ml-10000ng/ml較大的濃度范圍內(nèi)，回測濃度值和理論濃度的偏差在20%以內(nèi)，初步能夠判斷該方法具備較好的質(zhì)量。需要說明的此定量方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線僅僅是將親和力大小比較的劑量曲線刪除了上平臺期的最低濃度點(diǎn)。筆者大量的實(shí)踐表明定量方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線明確的平臺期點(diǎn)會嚴(yán)重干擾標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量準(zhǔn)確性。

本文以ELISA競爭法方法學(xué)開發(fā)和初步方法學(xué)驗(yàn)證的案例概論了功能學(xué)實(shí)驗(yàn)和定量實(shí)驗(yàn)的通用原則，包含以下幾個(gè)步驟：

1. 鑒于生物學(xué)方法的雙重間接性，明確檢測的目標(biāo)分子，設(shè)置多個(gè)陽性對照組和陰性對照組，理清信號值和檢測目標(biāo)分子的線性聯(lián)系；

2. 建立Test system，通過配體受體的結(jié)合實(shí)驗(yàn)，尋找合適的配體受體相對濃度以得到樣品對Test system的敏感性；

3. 加入梯度稀釋的樣品進(jìn)入Test system，繪制樣品相對于Test system的劑量全曲線；

4. 以實(shí)驗(yàn)?zāi)康臑閷?dǎo)向，分別對親和力大小比較為目的和大分子定量為目的進(jìn)行差異的濃度點(diǎn)選擇，并通過合規(guī)的方法學(xué)評價(jià)程序?qū)Ψ椒ǖ馁|(zhì)量進(jìn)行初步的評價(jià)。 

ELISA直接法和ELISA競爭法有相同的方法學(xué)質(zhì)量評價(jià)程序和標(biāo)準(zhǔn)，即親和力大小比較的方法學(xué)質(zhì)量評價(jià)程序和標(biāo)準(zhǔn)USP1032,1033,1034；定量分析的方法學(xué)質(zhì)量評價(jià)程序和標(biāo)準(zhǔn)2015版中國藥典第三部9012 生物樣品定量分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則或者美國FDA最新版本的Guidance for Industry Bioanalytical Method Validation。ELISA競爭法在相同的實(shí)驗(yàn)條件下對于對照品濃度點(diǎn)的微調(diào)可以完成親和力大小比較和大分子定量兩方面應(yīng)用，這個(gè)有別于筆者之前的文章ELISA技術(shù)應(yīng)用概覽和方法學(xué)開發(fā)初析對于ELISA直接法兩方面不同應(yīng)用不同的實(shí)驗(yàn)條件，但是兩類方法的四種應(yīng)用均能夠通過驗(yàn)證符合標(biāo)準(zhǔn)要求，只能說實(shí)踐出真知，不管白貓黑貓，能抓住老鼠的就是好貓了。

在體外所有的體外功能學(xué)實(shí)驗(yàn)中，樣品引起檢測體系的變化，并以信號的形式展示出來，這個(gè)應(yīng)該是體外生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法最通用的原則，有結(jié)合才會有功能，功能是對藥物引起的變化（響應(yīng)標(biāo)志物）的準(zhǔn)確定量。理解ELISA實(shí)驗(yàn)關(guān)于結(jié)合和定量的應(yīng)用以及方法質(zhì)量評估標(biāo)準(zhǔn)對于所有的功能學(xué)實(shí)驗(yàn)的開發(fā)和評價(jià)都有著十分重要的借鑒意義，ELISA里面有乾坤。

2012安進(jìn)公司的科學(xué)家宣稱53項(xiàng)癌癥著名論文中有47項(xiàng)無法重復(fù)，在生命科學(xué)研究領(lǐng)域，在追求創(chuàng)新性，第一性的同時(shí)，臨床前研究結(jié)果可重復(fù)性差，這個(gè)值得我們從業(yè)者去反思，也許基礎(chǔ)研究領(lǐng)域需要借鑒藥物研發(fā)企業(yè)的一些經(jīng)驗(yàn)，做好生物功能學(xué)方法開發(fā)和方法學(xué)驗(yàn)證的工作，在得到陽性結(jié)果前，先問一句，用來得到此陽性結(jié)果的實(shí)驗(yàn)方法是否可靠？